2.3.1 Justificación
La restauración forestal afectará la biodiversidad subterránea y aérea a través de formas físicas, químicas y biológicas al crear una gama de diferentes hábitats y nichos para diversos grupos taxonómicos de animales, plantas y hongos. La restauración de árboles, plantas forestales, musgos y comunidades de líquenes aumentará y diversificará la materia orgánica y los aportes de nutrientes al suelo mediante la adición de hojarasca, exudados radiculares y restos leñosos. Diferentes estructuras forestales también crearán varios microclimas y afectarán la estructura física de los suelos, a través del crecimiento de las raíces, la agregación de tipos de partículas del suelo, la aireación y el balance de agua en el ecosistema del suelo. Además de los estrechos vínculos ecológicos con las comunidades bacterianas, los sistemas radiculares de las plantas están intrincadamente vinculados con los hongos. Diferentes especies de hongos micorrízicos, que forman enlaces simbióticos con las plantas para ayudar con la absorción de nutrientes, estarán estrechamente asociadas con diferentes especies de plantas (Van Der Heijden et al 2007). Ascendiendo por la cadena alimentaria subterránea, los eucariotas microbianos (es decir, los protistas) son increíblemente diversos y se sabe que pastan en comunidades bacterianas (Adl et al. 2012). La meiofauna microscópica de metazoos (p. ej., nematodos, platelmintos de 45 a 500 mm) y, finalmente, los macroinvertebrados (p. ej., colémbolos, lombrices de tierra >500 mm) comprenderán diferentes grupos tróficos funcionales de depredadores, detritívoros, herbívoros y omnívoros. Sobre el suelo, la restauración forestal aumentará la diversificación del hábitat al crear complejidad estructural mediante el establecimiento de capas de dosel y sotobosque, pero también el crecimiento de arbustos más pequeños, hierbas y plantas de cobertura del suelo (Mestre et al. 2017). La complejidad estructural sobre el suelo creará una serie de microhábitats, definidos por diferentes temperaturas y niveles de luz, e impulsores químicos como los exudados de las hojas y la corteza. La madera muerta también impulsa la biodiversidad al crear hábitats únicos para una variedad de especies de invertebrados saprofitos.
Para desarrollar una comprensión rigurosa de la trayectoria de la condición de referencia para la restauración forestal, el proyecto SUPERB se propuso monitorear una porción completa y representativa de la biodiversidad aérea y subterránea. Esta diversidad taxonómica es, a su vez, representativa de los procesos ecológicos sucesionales que operan en diferentes escalas espaciales y temporales, proporcionando una base detallada para la evaluación. SUPERB empleó técnicas moleculares para generar inventarios de hongos, plantas, eucariotas microbianos, meiofauna y artrópodos a partir de muestras de suelo, así como inventarios de artrópodos voladores capturados en trampas Malaise.
2.3.2 Métodos de encuesta
Evaluar la biodiversidad mediante enfoques taxonómicos tradicionales es laborioso, consume mucho tiempo y requiere que diferentes especialistas identifiquen diferentes grupos del árbol de la vida (Creer et al. 2016). Incluso dentro de diferentes grupos taxonómicos, los taxónomos se especializan en diferentes grupos (por ejemplo, botánicos, briólogos, nematólogos) y en los suelos, la gran mayoría de la vida microbiana no se puede identificar mediante enfoques visuales (Curtis et al 2002). Los microbiólogos han estado utilizando enfoques genéticos moleculares para identificar la biodiversidad y construir filogenias durante varias décadas (Woese y Fox 1977), pero un punto de inflexión para la caracterización de la biodiversidad fue el concepto de código de barras de ADN estandarizado para la identificación de especies animales, vegetales y fúngicas, ideado a principios del siglo XXI (Hebert et al. 2003; Ratnasingham y Hebert 2007). El código de barras de ADN utiliza marcadores genéticos estandarizados para ayudar a identificar especies mediante la construcción de grandes bases de datos de referencia seleccionadas, posibilitadas por la deposición de especímenes de referencia y el intercambio abierto de datos, combinados con una interfaz web interactiva.
(https://boldsystems.org/) y enlaces a otras bases de datos globales de ADN. El código de barras de ADN utiliza cebadores de ADN altamente degenerados que amplificarán un marcador de código de barras de un gran número de especies, utilizando ADN extraído de individuos individuales. La región del código de barras se ha seleccionado para que sea lo suficientemente variable como para permitir que diferentes especies se identifiquen entre sí. Después de 2005, a través de los avances en la secuenciación de ADN de alto rendimiento, el campo de 'metabarcoding' ha evolucionado. En lugar de generar secuencias individuales a partir de especímenes individuales, el metabarcoding utiliza cebadores de ADN degenerados similares para amplificar regiones de código de barras, pero de comunidades completas de biota (Creer et al. 2016). La estandarización de los marcadores de ADN en el metabarcoding de ADN no es tan rutinaria como el código de barras de un solo espécimen (Deiner et al. 2017), pero en combinación, los dos enfoques están revolucionando el descubrimiento y la evaluación de la biodiversidad (Handley 2015). El material genético para la metacodificación de barras puede provenir de muestras ambientales (p. ej., suelo, aire, agua), pero también de comunidades o de ADN de muestras masivas (Creer et al., 2016; Deiner et al., 2017). En SUPERB, utilizamos ADN ambiental del suelo y ADN de la comunidad masiva de artrópodos Malaise (un tipo de muestreador de invertebrados voladores sobre el suelo) (Geiger et al., 2016) para evaluar la biodiversidad forestal.
Para caracterizar la condición de referencia prevista para proyectos futuros, el protocolo SUPERB adoptó un diseño de monitoreo que extrajo ADN de cinco muestras separadas de trampas de artrópodos con malestar (Geiger et al., 2016) y cinco muestras de suelo superficial, cada una compuesta por cinco núcleos (5 cm de ancho x 5 cm de profundidad). Para el muestreo de suelo y artrópodos, se adoptaron los estándares generados por el proyecto LIFEPLAN. Para las muestras con malestar, los artrópodos se pesaron primero (peso húmedo) y se homogeneizaron (Buchner et al., 2021). Tras la extracción de ADN, la amplificación por PCR y la preparación de la biblioteca se realizan mediante un proceso de codificación de barras de PCR de dos pasos (Bohmann et al., 2021). La primera ronda de PCR amplifica el ADN del marcador de código de barras elegido (p. ej., ITS para plantas y hongos, 18S para eucariotas microscópicos y CO1 para artrópodos) y la segunda ronda de PCR incorpora "etiquetas" de ADN conocidas a cada biblioteca de muestras para que cada PCR pueda rastrearse hasta la muestra original después de secuenciar múltiples muestras en la misma ejecución de secuenciación de Illumina (Deiner et al., 2017; Bohmann et al., 2021). Estas técnicas son cada vez más frecuentes en la investigación de las agencias forestales (p. ej., Barsoum et al., 2018), pero siempre que sea posible, se recomienda a los usuarios buscar asesoramiento de biólogos moleculares y ecólogos para aprovechar al máximo los avances tecnológicos.
2.3.3 De la recopilación de datos a la presentación de informes de datos
La metacodificación de barras genera grandes volúmenes de datos de secuenciación en formatos de archivo especializados que se procesan mediante un proceso bioinformático multietapa para determinar qué taxones se han detectado en qué muestras. Una opción de proceso bioinformático se denomina DADA2 y lleva los archivos a través de una serie de pasos de control de calidad, filtrando y depurando los datos, fusionando lecturas de secuenciación directa e inversa y eliminando errores (Callahan et al., 2016). Los pasos bioinformáticos iniciales reducen considerablemente la complejidad del conjunto de datos, reduciéndolos a las secuencias únicas detectadas en la muestra ambiental. Para identificar grupos de secuencias que representan una aproximación de especies, se utilizan algoritmos para agrupar secuencias de ADN similares (SUPERB adoptó un estándar común del 97 %) (Rojnes et al., 2016) y, a continuación, comparar los grupos resultantes con una base de datos seleccionada de secuencias conocidas para encontrar un nombre taxonómico coincidente. Los datos taxonómicos resultantes enumeran en qué muestras y rodales se detectó una especie y pueden utilizarse para calcular diversas métricas comunes de diversidad ecológica.
